帶你從0開始PCR實驗室建設(shè)

基因擴增實驗室，PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)。

PCR是分子生物學研究和實驗的常規(guī)方法，廣泛應(yīng)用于生物學各個領(lǐng)域，例如：艾滋病檢測、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷，DNA指紋、個體識別、親子鑒定及法醫(yī)物證，動、植物檢疫，動物及其衍生產(chǎn)品檢測，動物飼料、化妝品、食品衛(wèi)生檢測，轉(zhuǎn)基因作物與轉(zhuǎn)基因微生物檢測等。

平均每1~2年發(fā)生一次傳染病重大疫情，如2003年的重癥急性呼吸綜合征（SARS冠狀病毒），2005年的禽流感病毒（HSN1禽流感病毒）, 2008年的手足口（腸道病毒），2011年的發(fā)熱伴血小板綜合征（新布尼亞病毒），2013年的流感病毒（H7N9病毒），2014年的禽流感（H10N8病毒）和埃博拉病毒，2015年禽流感病毒（H5N6病毒），2016年的塞卡病毒，以及目前的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19病毒）。疫情爆發(fā)突出表現(xiàn)為發(fā)病急、進展快、傳染性強，因而傳染病病原體的快速、準確鑒定，成控制疫情關(guān)鍵因素。此類疾病的診斷大部分是通過核酸擴增的方式來實現(xiàn)檢測的，而該過程均需要在高標準的PCR實驗室中由專業(yè)人士操作完成，因而PCR實驗室在傳染病重大疫情防控中的疾病診斷和服務(wù)成為不可或缺的力量。除了病毒類傳染病，PCR實驗室可開展的病原微生物檢測包括細菌類、真菌類以及原生動物等疾病的診斷，如臨床常見的巨細胞病毒、EB病毒、結(jié)核分枝桿菌、甲乙型流感病毒肺炎、支原體及衣原體感染、乙肝、丙肝、戊肝等，PCR實驗室在疾病診斷和控制中起到極為重要的作用。

標準的PCR實驗室分為四個區(qū)域:試劑貯存和準備區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染,進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行,即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴増反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。

PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實驗，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程。

1、分散形式PCR實驗室

所謂分散形式PCR實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。

2、組合形式PCR實驗室

所謂組合形式PCR實驗室,是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。

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PCR實驗室主要功能

1、試劑儲存和準備區(qū)的功能

貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應(yīng)當直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過擴增檢測區(qū)，試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應(yīng)當保存在該區(qū)，應(yīng)當保存在標本處理區(qū)。

2、標本制備區(qū)的功能

核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護設(shè)備、個人防護和操作規(guī)范的要求。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。

3、核酸擴增區(qū)的功能

DNA合成、DNA擴增及檢測。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)當盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打開。

4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)的功能

擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標記或非放射性核素標記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜分析等。

擴增產(chǎn)物分析區(qū)是PCR實驗室最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此應(yīng)注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)當至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故應(yīng)當注意實驗人員的安全防護。

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PCR實驗室建設(shè)要點

1、主體結(jié)構(gòu)

主體為潔凈彩鋼板和鋁合金型材。房間內(nèi)外角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，解決了易污染、積灰、清洗困難的問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡潔美觀大方，密封性能好。

2、標準的三區(qū)分隔和壓差控制

將PCR過程分為試劑制備、樣品制備和PCR擴增檢測三個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立的實驗區(qū)都有一個緩沖區(qū)。

PCR實驗室空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求,但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性,宜采用全送全排的氣流組織形式。同時,要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。

3、消毒

紫外線燈安裝在三個實驗區(qū)、三個緩沖區(qū)的頂部和轉(zhuǎn)移窗內(nèi)進行消毒。在試劑制備區(qū)和標本制備區(qū)還設(shè)置移動式紫外線燈，對實驗臺進行局部消毒。

4、機械連鎖不銹鋼傳遞窗

試劑和標本通過機械聯(lián)鎖不銹鋼（不推薦電子聯(lián)鎖）傳輸窗口傳輸，確保試劑和標本在傳輸過程中不受污染（人物分流）。

5、地面

地面一般采用PVC卷材地面或自流地板，整體性好。易清潔，耐腐蝕。也可以使用水磨石地面，或大瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。盡量避免產(chǎn)塵和積塵現(xiàn)象。

6、照明

燈具應(yīng)選用凈化燈具，便于清潔、無塵。

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PCR實驗室主要儀器設(shè)備

1、試劑準備區(qū)儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機等,加樣器、天平除了要專用外,還應(yīng)定期校準。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進行擴增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學級的,試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢:一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果；

2、標本制備區(qū)儀器設(shè)備主要有生物安全柜、加樣器、離心機、溫育儀、混勻器等；

3、擴增區(qū)的主要儀器是核酸擴增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機可移動紫外燈。擴増儀需進行校準。并配備UPS電源,以防止由于電壓的波動,停電對擴增效果的影響。

4、分析區(qū)所使用的儀器設(shè)備主要有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱、DNA測序儀等。